細胞凍存和復蘇經(jīng)驗總結

2016/11/29　　閱讀(53)

    細胞凍存過程對保持細胞狀態(tài)影響巨大，李記生物結合多年實踐，總結出如下實用的細胞凍存流程。 “慢凍快融” 是細胞凍存及復蘇的基本原則，這對zui大限度的保存細胞活力至關重要。目前細胞凍存多用甘油或二甲基亞砜（DMSO）作為保護劑，這兩種物質能提高細胞膜對水的通透性；細胞凍存和復蘇時，減少細胞內冰晶產(chǎn)生是關鍵。緩慢冷凍可使細胞內的水分滲出細胞外，減少細胞內冰晶的形成，從而減少冰晶對細胞的物理損傷。復蘇細胞采用快速融化的方法可以保證細胞外結晶在很短的時間內融化，避免由于緩慢融化使水分滲入細胞內形成胞內再結晶對細胞造成損傷。

細胞凍存操作流程：

1、細胞凍存前12~24h，換新鮮培養(yǎng)基，使細胞一直處于對數(shù)生長期。

2、待細胞長至80%匯合時胰酶消化，用新鮮培養(yǎng)基吹打后制成細胞懸液，1000rpm離心10min。懸浮細胞則直接離心。

3、棄上清，加入凍存液重懸細胞沉淀，調整細胞濃度為3×106~1×107cells/mL。將細胞懸液分至凍存管內，每管1~1.5mL，擰緊蓋子。在管壁上做好標記，標明細胞名稱、凍存日期等。（細胞凍存液配方可為胎牛血清：培養(yǎng)基：DMSO=4：6：1或胎牛血清：培養(yǎng)基：DMSO=1：9：1或胎牛血清：DMSO=9：1，可根據(jù)各實驗室實際條件調整）

4、按下列順序依次降溫：室溫→4℃ 20min →-20℃ 30min →-80℃放一晚→液氮保存。也可使用程序降溫盒更為方便，細胞凍存管放入程序降溫盒內可直接放入-80℃放一晚，再轉至液氮罐內。注意程序降溫盒內異丙醇的量必須高于zui低刻度線；凍存5次后異丙醇需要跟換一次，以免影響凍存效果。

5、細胞凍存后應取出一管復蘇，檢測細胞的存活率。理論上細胞可在液氮內長期保存，為穩(wěn)妥起見可在細胞凍存半年后復蘇培養(yǎng)，觀察細胞生長情況，再繼續(xù)凍存。

細胞復蘇操作流程：

1、將培養(yǎng)基在37℃水浴鍋預熱；準備一個15mL無菌的離心管，加入8mL預熱培養(yǎng)基。

2、將凍存細胞從液氮罐中取出，快速放入37℃水浴鍋中復溫（可準備一潔凈的燒杯，裝滿37℃的水，細胞凍存管取出后迅速放入燒杯內，再逐步轉移到水浴鍋中）。輕輕晃動凍存管，使細胞能在1~2min內*解凍，使細胞能盡快通過zui易受損的溫度段（-5~0℃）。注意凍存管管口不能沒入水中，避免引起污染。

3、用75%酒精擦拭凍存管后再置于超凈臺內，將管內細胞轉移至準備好的離心管內，輕輕吹打液體，使細胞均勻分散，降低DMSO濃度，吹打時避免產(chǎn)生氣泡。用新鮮培養(yǎng)基洗管壁2次，均轉移至離心管內。

4、800rpm離心5min，棄上清，加入新鮮的培養(yǎng)基，吹打制成細胞懸液。

5、將細胞懸液轉移至T25細胞瓶內，補加適量的培養(yǎng)基，輕輕晃動細胞瓶使細胞分布均勻，放入溫箱內培養(yǎng)。

6、第二天觀察細胞貼壁生長情況，換新鮮培養(yǎng)基以去除死細胞。繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞長至80~90%匯合時正常傳代。一般剛復蘇的細胞需經(jīng)過2~3次傳代，細胞活力恢復后才能進行后續(xù)的實驗。

對DMSO不敏感的細胞在復蘇時也可不離心，減少操作步驟，也可降低污染的幾率。將解凍的細胞懸液直接轉移至T25細胞瓶內，補加新鮮培養(yǎng)基，放入溫箱內培養(yǎng)。但培養(yǎng)12~20h后必須換新鮮的培養(yǎng)基，移除死細胞。